DNA定点突变定点诱变(DpnI法)1、引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp，设计的突变位点需位于引物中部。 2、反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。 反应体系： 10x pyrobest Buffer 5ul dNTP Mixture(10mM) 1ul 模板DNA(5~50ng) 1ul primer 1 (125ng) 1ul primer 2 (125ng) 1ul pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul 加无菌蒸馏水至50ul 3、产物沉淀纯化：加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min,离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切） 4、DpnI酶切：Buffer 2ul BSA（100╳） 0.2ul DNA x ul DpnI 0.5ul 加无菌去离子水至 20ul 30゜C酶切1~4 h ；65゜C 水浴15min终止反应。 5、将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。 6、测序验证 载体多克隆位点（MCS）改造加、减、换一个载体的MCS的位点（给一个表达载体加、减、换小表达标签，如His6， His10，strep II等，和MCS改造是一样的），其实技术不是问题，问题在于位点的选择，因为载体设计时应该设计者也考虑过mcs的问题，应该给使用者越多的选择越好，但为什么有的载体只给有限的几个位点呢，一可能是这个载体其他部位本身含有的限制性切点比较多，因而MCS位置的选择比较少，二就是设计者是自用的载体，没有考虑到我们的感受。 步骤如下： 1、找到载体全序列，查找有没有你想要加的位点（Primer premier5……一堆软件，再不济了用word），如果没找到你想加、减、换的位点，恭喜了，革命要成功了； 2、方法上不太推荐点突变或其他以overlap PCR 为基础的技术，推荐小片段克隆，也就是做shRNA 载体的那种方法，人工合成（按引物合成）你想要的MCS序列的正反链，两端加上载体上两个切点的粘末端序列，人工退火（95度10min，然后每分钟降5度直至Tm值下5度，维持10min，即可），不用电泳检验，直接按克隆的连接体系将这个小片段与你的载体（相应酶双切）连接转化…… 小片段连入的效率相当高，如果大家要检验：在菌长出来后，做PCR检验（人工合成的这个小片段的正链或反链与载体上的引物）。举个例子： 比如要在某载体的EcoR I和BamH I之间加一个新的MCS（EcoR V－Kpn I－Xho I－Hind III）（这几个位点必须在目的载体上没有，如果有这个切点，你又实在想用的话，可以将目的载体用这个酶单切，绿豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化，再自连——位点封闭）： 1、合成 5‘－AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G -3' 3'－ G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5' EcoR I粘末端 EcoRV Kpn I Xho I Hind III BamH I粘末端；（这里面有几个要点，合成时直接合成粘末端，省得再切，这样既省合成的钱，效率又高，如果你需要在改造后的载体继续使用原载体的连入切点，比如上面例子的EcoR I和BamH I，你像例子中一样可以合成完整的酶切位点粘末端，如果你不想使用它们，那就只合成粘末端，比如上面那个例子，应合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……这样连接后，EcoR I切点就被封闭了；再有要注意考虑连入位点之间要留一定的间隔，因为靠着的两个酶是很难双切开的，有时候分步切都没用，因为留给酶结合的空间太小，没法结合l ，一般按照相邻两个酶的推荐保护碱基数中较大的数目留，万无一失啊） 2、退火，如上； 3、克隆，同上； 4、检验，同上。测序，收工。
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