基因克隆

一、Gateway技术：克隆、表达新方法

1、一种更好的克隆方法

Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。

图1 Gateway技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

2、一项强大而可靠的技术

Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

表1 反应和术语总结

图2 Gateway技术总结

在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：

（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）

有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。

（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）

（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体

（3）使用pCMV•SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库

（4）Gateway改造过的克隆资源*

* 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。

这些克隆可以通过与供载体及BPGateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。

3、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆

定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。

目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：

位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组

通用M13位点便于测序

基于pUC的ori位点提供高产量质粒

大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选

表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较

图3Gateway定向TOPO克隆

4、构建入门载体的各种选择

（1）限制性内切酶消化

作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。

（2）PCR重组克隆

重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体（包含attP位点）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组（参看图2）。

（3）Gateway改造过的cDNA文库

如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。

SuperScript cDNA文库使用pCMVSPORT构建，有几种人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。

（4）入门克隆的切入点——克隆资源

您可以从与10000个人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70%以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术、oligo dT引物以及SuperScriptII 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGen库或UltimateORF库。

克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。

图4 进入Gateway系统的各种路线

* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组

5、触手可及的最高级表达系统

一旦您构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。

图5 在Gateway系统表达全长开放阅读框

大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞（杆状病毒）或大肠杆菌BL21-SI菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达。在Hartley， J.L.et al. (2000) Genome Research10(11):1788-95 可以找到更多的细节。

为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你可以很容易地把您自己最称手的表达载体转换成Gateway目的载体。

二、Cre-loxP 基因重组技术

re-loxP 是一种位点特异的基因重组技术，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，在真核生物和原核生物中均有广泛应用。
1、Cre-loxP 的基本原理

Cre 蛋白是一种重组酶，是causesrecombination的缩写，于1981 年从 P1 噬菌体中被发现，属于λInt 酶超基因家族。Cre 重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL 数据库登录号为 X03453），编码 38kDa 蛋白质，Cre 重组酶是由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。LoxP 位点，是 locus of X-over P1的缩写，是位于 P1 噬菌体中的 34bp 序列，由两个 13bp 的反向回文序列和 8bp 的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定 loxP 的方向，loxP 位点的序列如下所示：

13bp 8bp 13bp

ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT

Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即 loxP 位点，使两个loxP位点间发生基因重组。Cre 重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环状甚至超螺旋 DNA。

2、Cre-loxP 诱导基因重组的几种方式

当细胞基因组内存在两个 loxP 位点时，一旦有 Cre 重组酶出现，就会诱导两个 loxP 位点间的序列发生重组。首先，Cre 重组酶结合到两个 13bp 的回文序列形成二聚体，然后这个二聚体和另外一个 loxP位点上的二聚体结合，形成四聚体。LoxP 位点是有方向的，形成四聚体的两个 loxP 位点是平行的，随后这两个 loxP 位点间的双链 DNA 被 Cre 重组酶切掉，然后切口在 DNA 连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于两个 loxP 位点的方向，主要有以下几种可能：

1.如果两个 loxP 位点位于一条 DNA 链上，且方向相同，Cre 重组酶能有效敲除两个 loxP 位点间的序列（图1A）；

2.如果两个 loxP 位点位于一条 DNA 链上，但方向相反，Cre 重组酶能导致两个 loxP 位点间的序列翻转（图1B）；

3.如果两个 loxP 位点分别位于两条不同的 DNA 链或染色体上，Cre 酶能介导两条 DNA 链的交换或染色体易位（图1C）。

3、Cre-loxP 系统的优点

在当今世界上，Cre-loxP系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，主要是因为该系统有如下优点：

图1. Cre-loxP诱导基因重组的方式，敲除（A）、翻转（B）、易位（C）

（1）高效性：Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重组过程简约高效；

（2）特异性强：loxP位点是一段含回文序列结构和中间有间隔的34bp元件，这种结构保证了loxP序列的唯一性，从而保证基因重组的特异性很强；

（3）可应用范围广：Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用，所以说Cre-loxP系统的可应用范围非常广；

（4）可由二型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的胜利条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。

4、Cre-loxP系统的操作方式

（1）转基因动物依赖的基因重组

一般情况下，科学家们利用Cre-loxP系统进行基因操作时，会采用两种转基因动物进行杂交，即一种带Cre的转基因动物和一种带loxP序列的转基因动物进行交配，使得后代既带Cre又带loxP基因，然后Cre重组酶会识别loxP位点，导致基因重组（图2）。由于Cre基因的表达受上游启动子的调控，这样启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。虽然该方法可以实现高效、特异的基因重组，但是以下不足限制了用转基因动物进行基因操作的发展：

1) 转基因动物的难以获得：目前虽然已经有一些Cre和loxP转基因动物，但是要获得这些转基因小鼠比较困难，特别是对于国内的科研工作者来说。而且还有很多Cre和loxP转基因动物没有被制作出来，或者没有公开发布或者在公共平台上保存，如果要自己制作转基因动物的话，非常耗时间而且成本也很高，因此说要获得需要的转基因动物比较困难；

图2.用Cre和loxP转基因老鼠进行基因敲除操作

2) 动物交配很耗时间：转基因动物达到实验室后，首先需要将转基因动物的数量扩大，然后经过至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2个月时间，所以至少需要半年时间才能拿到基因敲除的小鼠，因此说转基因动物的交配很耗时间；

3) 区域或者组织特异性不高：因为转基因小鼠依赖的基因敲除的特异性只能依赖于启动子的调控，而有些启动子并不能完全符合科研工作者对于区域或者组织特异性的要求，这样就会使实验结果不精确。

（2）病毒依赖的基因重组

由于转基因动物依赖的基因重组存在以上不足，现在越来越多的科研工作者开始采用比较灵活的方式使用Cre-loxP系统。通过病毒引入Cre或loxP元件，结合一种转基因小鼠是比较常用的方式（图3）。相比于转基因动物依赖的基因重组，病毒依赖的基因重组有以下优点：

1) 更强的区域特异性：由于病毒可以通过局部注射的方式保证区域特异性感染，再加上驱动Cre基因的特异性启动子，能够实现更强的区域和细胞特异性的基因重组；

2) 更少的花费：购买转基因动物的费用一般是比较昂贵的，而且转基因动物的饲养、基因型鉴定都需要不少的人力、物力，而病毒的制备、保存和注射所花的费用相对来说是比较少的；

3) 更短的实验周期：由于病毒能非常迅速的起作用，而转基因小鼠的交配过程特别耗时间，因此采用注射病毒到转基因小鼠体内的方式，可以大量缩短实验周期。

图3. 病毒依赖的基因敲除操作示意图，注射Cre病毒进loxP转基因小鼠体内（A），或者注射loxP病毒到Cre转基因小鼠体内（B）

改造的Cre-loxP系统经过现代基因工程方法对Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系统实现了更加丰富的条件性重组策略。

（1）对Cre元件的改造：对Cre元件的改造提高了Cre重组酶的活性，并且实现了药物可诱导性。例如，通过在Cre元件上引入真核细胞核定位序列NLS，Cre重组酶能在低表达丰度下实现重组，这对于一些低丰度的启动子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造过的配体结合结构域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD将定位在胞浆内，当人工合成的激素分子结合到Cre-LBD受体后，蛋白构象改变并进入核内，介导基因重组，目前使用最多的是tamoxifen诱导的CreERT2突变体，它的LBD来自于雌激素受体ER分子，当有tamoxifen的时候，Cre才能介导基因重组，这样通过控制tamoxifen的注射时间，可以实现对基因重组时间特异性的调控；

（2）对loxP元件的改造：loxP元件也有一些突变体，间隔区和回文序列都可以进行突变，突变后的序列依然能被Cre重组酶识别和重组，但是突变的loxP序列必须和同样突变的loxP序列匹配介导基因重组，而不能和未突变的loxP序列匹配，这样将不同的loxP序列组合用于控制多个基因，在同一Cre重组酶的作用下，可以实现多序列的基因重组，产生非常多元的重组结果。例如彩虹脑（Brainbow）技术绚丽多彩的荧光标记效果正式基于对loxP序列的改造实现。

三、阳性克隆筛选方法汇总

基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9基因敲除方法

近几年来，基因重组的技术层出不穷，包括TALEN和CRISPR/Cas9在内的重组技术给基础研究提供更为方便和快捷的分子生物学工具。

关于这些技术的具体原理和操作细节，这里不做展开介绍，主要谈一谈在用这些技术进行细胞株构建的过程中，如何做才能加快阳性克隆筛选的步伐,做好这个关键的步。

1、混合克隆pool验证

质粒转染后48-72小时后取转染后细胞的pool1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞做有限稀释，一般5块板足够。

分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物PCR扩增目的基因片段，与野生型目的基因杂交后CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1.5%-2%凝胶电泳。

上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。这一步尤为重要，很多杂志投稿时需要这张图，或者有计算突变率的要求。

2、阳性克隆筛选

上一步采用有限稀释法接种到96孔板中的克隆，待到单个细胞长到几百到1000个细胞左右时，取出其中的一半细胞提取基因组。分析敲除位点的上下游序列，设计合适的引物，并从提取的基因组中扩出目的片段，然后选择CruiserTM或者T7E I进行酶切分析，最后将酶切分析得到的阳性克隆再进行测序进行最终确认。

此图为两个阳性克隆的酶切结果，先酶切再测序不仅可以避免单一方法出现的假阴性，而且可以满足大部分杂志会要求，以免被要求补数据。

为了可以很快的筛选到阳性克隆可以通过如下几个方式去进行优化：

（1）尽可能提高单细胞的存活率。

a)对于单个细胞很难存活的细胞，如果是贴壁细胞，可以试着加一些细胞因子促进细胞的分裂；而对于悬浮细胞，则推荐采用Cell Plaza（共培养的原理），都可以极大的提高细胞的存活率；

b)对于很容易老化的细胞，推荐对细胞进行永生化改造，永生化的方法有很多，这里不做具体推荐。

（2）采用能够快速抽提微量样品基因组DNA的试剂盒。

这样的试剂盒，市面上也比较多，但是需要注意选择针对样品量比较少的试剂盒，建议选择QIAGEN或者Genloci的微量样品的抽提试剂盒。QIAGEN是老品牌，Genloci这家公司是主要做基因重组的，所以，他们开发的一些产品针对性比较强，而且价格便宜，建议优先使用。

（3）设计合理的引物和选用高保真的Taq酶；

引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处，或者上游200bp和下游100bp处，这样的好处是后面进行酶切分析的时候，对于阳性的克隆，可以很容易观察到2条分开的条带。

Taq酶，建议是用NEB的Fusion或者Q5，毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失，所以，高保证是必要的，防止产生假阳性的结果。

4、选择高特异性的错配酶；

目前用的比较多的是CEL I和T7E I 两种酶，CEL I是植物来源的一种特异性识别碱基错配的酶，活性高，不会产生假阳性。目前市面上只有CruiserTM和Surveyor和两个品牌。其中Surveyor是进口代理产品，价格较贵，货期较长；CruiserTM价格合适，同时货期短，国内可以2-3天内到货，做到真正质优价廉。

T7E I是NEB的产品，最早并不是为了做基因敲除筛选用的。其最主要的特点是除了识别错配外，还可以识别十字型结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA，正是因为这个特点，很容易导致假阳性的现象。

图1.Holliday交叉（Hollidayjunction），无错配结构

（5）选择服务好的测序公司测序公司往往是比较容易忽略的一个环节，很多人送测序后，拿到的测序结果经常发现没信号，就认为是自己的样品有问题，而不会去怀疑测序公司。实际上是错误的思维方式，测序是苦力活，人员流动比较大，所以经常会发现某一段时间的测序结果总是不好，实际上跟样品无关而跟测序公司的人员流动有很大关系。所以，一定要找一些资质比较好的测序公司，同时，发现问题的时，可以考虑换一家公司再测一遍。