原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求

1.组织取材：

组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。

2.固定目的是：

（1）保持细胞结构；

（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；

（3）使探针易于进入细胞或组织。

最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

3.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：

（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。

（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。

（3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。

4.杂交缓冲液孵育：

杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。

5.防止污染：

由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。

6.双链DNA探针和靶DNA的变性：

杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交（包括检测RNA时），双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。

杂交液：

杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。

杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。

所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。

在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。

探针的浓度：

探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5~5.0 μg/ml（0.5~5.0 ng/μl）。最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。

探针的长度：

一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。

二、试剂准备

1.0.1 M PBS (pH7.2)：Na₂HPO₄•12H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄•2H₂O 5.6 g、NaCl 9 g，加ddH₂O至2000 ml，高压灭菌。

2. 0.2 M PB ((pH7.2)：Na₂HPO₄•12H₂O 61.6 g、NaH₂PO₄•2H₂O 5.6 g 加ddH₂O至1000 ml，高压灭菌。

3. 0.1 M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1 M PBS，定容至100 ml，高压灭菌。

4. 4%多聚甲醛：多聚甲醛40 g加ddH₂O 400 ml，加热至70℃左右，用1 M NaOH调pH至7.0，用ddH₂O定容至500 ml，再加0.2 M PBS 500 ml，总体积为1000 ml。

5. 16×Denhardt溶液：聚乙烯吡咯酮0.4 g、小牛血清白蛋白（BSA） 0.4 g、聚蔗糖0.4 g，加dd H₂O至10 ml，无菌抽滤、分装， -20℃保存备用。

6. 预杂交液：去离子甲酰胺10 ml、50%硫酸葡聚糖4 ml，于50℃促溶后，再依次加入16×Denhardt液0.2 ml、1 M Tris-HCl(pH 8.0)0.2 ml、5 M NaCl 1.2 ml、0.5 M EDTA(pH8.0) 0.04 ml、0.1 M 二硫苏糖醇 2 ml、ddH₂O 2.21 ml，总体积为10ml。无菌抽滤、分装，-20℃保存备用。临用前加入50 mg/ml 变性鲑鱼精DNA 75 μl/ml。

7.20×SSC: NaCl 175.3 g、柠檬酸三钠88.2 g，加水至800 ml，用2 N NaOH调pH至7.0，再用ddH₂O定容至1000 ml。

8.抗体稀释液：Triton X-100 80 μl、BSA0.2 g，以0.05 M PBS定容至20 ml。

9.TSM1：1 M Tris-HCl(pH 8.0)10ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1ml，加ddH₂O 100 ml。

TSM2（新鲜配制）：1 MTris-HCl(pH 9.5)10 ml、5 M NaCl 2 ml、1 M MgCl₂ 1 ml，加ddH₂O至100 ml。

显色液（临用前现配）：5 ml TSM2 加显色液原液（NBT/BCIP）150μl，并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24μg/ml，避光。

三、操作步骤

（一）取材、冰冻切片：

将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。

（二）探针制备与检测（定量）：

1.随机引物制备cDNA核酸探针以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：

（1）探针制备：

①模板DNA(0.5-3 μg) 15 μl，100℃变性10 min，冰浴5 min。

②在冰浴中加：Hexanucleotidemix 2 μl， dNTPmix 2 μl，Klenow Enzyme 1 μl，反应总体积为20 μl。37℃孵育过夜。

③在上述20 μl 的标记产物中加4 M LiCl 2.5 μl，75 μl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20℃放置 2 hr。4℃离心12 000 g×15 min，弃上清。70%乙醇（预冷） 50 μl 洗涤，7 500 g×5 min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解沉淀，-20℃保存备用。

（2）探针敏感性检测：

①样品稀释：取dig-标记探针1 μl 用ddH₂O以1：10、1：100、1：1000、1：1000、1：10000梯度稀释。

②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH₂O中浸泡 1 min，6×SSC中浸泡10 min，置点样器上，负压抽吸5 min。

③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10 min。

④取下尼龙膜，置紫外灯下10 cm 处照射5 min，晾干。

⑤将膜置于适量预杂交液（5-10 ml）中，37℃预杂交10 min。

⑥加入Anti-dig 抗体（1：5000），37℃杂交30 min。

⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10min×2次。

⑧显色：15 ml TSM2中加300 μl 显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30 min。

2.PCR法制备cDNA核酸探针：

（1）探针制备：

以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：在0.5ml 离心管中，依次加入：PCR引物 1（10 pM） 2 μl；PCR引物 1（10 pM） 2 μl；质粒DNA 模板（10-100 pg） 2 μl；PCR DIGmix 2 μl (含dNTP和DIG-11-dUTP)；dNTPmix 2 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl；加入适量ddH₂O，使总体积达50 μl。

①将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃60 s，循环30-35次，最后在72℃保温7 min。

②在上述PCR产物中加入4 M LiCl 12.5 μl、预冷无水乙醇375 μl，轻轻混合后置于-20℃2 h，12 000g×15 min，弃上清。70%乙醇(预冷) 120 μl 洗涤沉淀，离心7500g×5min，弃上清，晾干沉淀，加TE 50 μl 溶解，-20℃保存备用。

（2）探针检测：

进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。

（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：

1. 0.1 M PBS (pH 7.2) 浸5-10 min。

2. 0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。

3. 0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15min。

4. 0.1 M PBS 洗 5 min×3次，加蛋白酶K(1 μg/ml)，37℃孵育30 min。

5. 4%多聚甲醛浸5 min。

6. 0.1 M PBS 洗 5 min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。

7. 预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。

8.杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20 μl 杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。

9.洗片：

4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；

0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1 M PBS各半洗10 min；

0.05 M PBS 洗 5 min×2次。

10. 3% BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。

11.滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀释）4℃孵育过夜。

12. 0.05M PBS洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次；新鲜配制TSM2 10 min×2次。

13. 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。

14. 将玻片置于TE中10-30 min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。

15.显微镜下观察结果。

四、注意事项：

1. 作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。

2.cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5 min，冰浴骤冷。