GST pull down实验流程
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活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions GST pull down 实验流程
本文主要介绍了 GST pull-down 实验的服务流程（数据以实际实验为准）
GST 蛋白的表达
1. 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入BL21 大肠杆菌菌株中；
2. 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液；
3. 将种子液稀释于 50ml 2x YTA(YTG+Amp)培养基中，使起始 OD600 为 0.1；
4. 28℃,220rpm 摇菌培养 2 小时；
5. 加入 50μl 100mMIPTG,16～27℃摇菌培养 1～8 小时；
6. 收菌，将菌液倒入大离心管，2 管/50ml 菌液，4℃5000rpmx5min 离心，弃上清；
7. 加入 10ml PBS/管，重悬细胞,5000rpm离心 5min，弃上清；
8. 超声破壁，将裂解液分入 1.5ml 离心管中，4℃离心 12000rpm×10min，取上清；
9. 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min，离心（12000rpm,1min），取上清 SDS-PAGE
电泳，检测表达情况；
gst pull down 实验流程
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活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions 准备 50% GST 琼脂糖凝胶
10.将原 75%谷胱甘肽琼脂糖凝胶的浆液弹至混匀;
11.取 677μl 原液/管，3000rpm 离心 5min，弃上清；
12.加 500μl PBS，颠倒混匀，3000rpm离心 5min，弃上清，反复 5 次；
13.加 500μl PBS，颠倒混匀，配成 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶备用；
GST 蛋白的纯化
14.在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入 20μl 50%谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～
60min；
15.3000rpm 离心 5min，弃上清；该琼脂糖凝胶上即结合了 GST 融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或
者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）；
16.在管中加入离心后的 1.5ml 新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应 30min～60min。3krpm 离心 5min，
弃上清。重复该步骤多次，就可以使琼脂糖凝胶上结合 6～10ml 裂解液中的 GST 融合蛋白；
17.在管中加入预冷的 200μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将
琼脂糖凝胶洗涤一次， 3000rpm 离心 3min，弃上清；
18.反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得
结合有 GST 融合蛋白的琼脂糖凝胶；
19.如果用于检测，在谷胱甘肽加入 15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮 3min。12000rpm 离心
1min，取上清作 SDS-PAGE 电泳；
20.结合的 GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱；
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活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions 检测
21.将结合有 GST 融合蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶悬浮在 500μlNETN 缓冲液中加入 20～30μl 含有其他蛋白
的溶液同时采用结合有 GST 空蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶平行操作作为对照；
22.在水平摇床上，4 晃动 4～8 小时；
23.离心（3600rpm,2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖球珠；
24.加入 200μl 缓冲液对琼脂糖凝胶进行洗涤。注意加入缓冲液时要贴壁加，不要直接冲击琼脂糖凝胶，随后
轻柔晃
动，使其重悬即可；
25.低速离心（3000rpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的琼脂糖凝胶；重复步骤的洗涤 2～3 次；
26.吸干琼脂糖凝胶上方的水层后，加入 20～30μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴 4min，冻存于－20℃；
27.做 SDS-PAGE 和 Western 检测另一个蛋白；
GST-pull down 的对照问题
28.做 SDS-PAGE 时点一个 input 的蛋白（即 B-6＊His）阳性对照，看一下Western 操作过程中试剂、操作
步骤有没有问题
29.谷胱甘肽琼脂珠上只固定GST 蛋白，inputB-6＊His，用于做阴性对照，看一下是否 GST 会与 input 的蛋
白相互作用
相关服务：GST pull-down 服务
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活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
