实验前准备
1.实验设计与分组
2.实验试剂、耗材、仪器准备
3.试剂盒：Pierce™ Agarose ChIP Kit
实验步骤（以哺乳动物贴壁细胞为例）
A．交联与细胞裂解
1.用15cm培养皿培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107
个，待用。
以下步骤基于1次ChIP试验
2.交联：向每个含有培养液的培养皿中，加入16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%.
轻轻晃动培养皿, 使混匀, 室温孵育10min.（交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产生假阳性）
3.终止交联：向上述培养皿中，加入10X的甘氨酸溶液使其终浓度为1X的。混匀，室温孵育5min。
4.吸出培养皿中含有甲醛-甘氨酸的混合培养基。用1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。
5.在1ml预冷的PBS加10μl的Halt Cocktail。然后将此混合液加入清洗后细胞中，再用细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液用移液器转移到1.5m的微管离心管中。
6.将搜集的细胞于3000g离心5min。除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进行一下步骤：酶解
B．酶解断裂染色质
1.准备好上述交联好的细胞。如果是冻存的，需在冰上解冻。
2.加100μl含蛋白酶抑制剂的Lysis Buffer 1至细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离心管15s，置于冰上孵育10min；9000g离心3min，弃除上清。
3.加0.25μl的Micrococcal Nuclease (ChIP 级) (10 U/μL)，涡漩离心管，在37°水浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀；
4.加10μl的MNase stop 溶液终止反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。
5.9000g离心5min，去上清，重新获得核酸复合物。
6.用50μl的含（蛋白酶/磷酸蛋白酶）抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。
7.9000g离心5min。将酶解后含有染色质的上清液转移到一个新的1.5ml的离心管中。继续IP实验或者将样本储存在-80°。
C．免疫沉淀蛋白-DNA复合物
1.取5μl上述50μl酶解后含有染色质片段上清液置于1.5ml 离心管，-20°保存
2.向剩余的45μl的上清液中加入450μl 1X IP Dilution buffer.
3.加入一抗及500μl的稀释裂解液到Plugged spin colum。并置于摇晃平台上，4°孵育过夜。抗体加入量如下：
阳性对照组：加10ul Anti-RNA聚合酶II抗体
阴性对照组：加1-2μl的正常的兔IgG
实验待测样本组：特异性抗体浓度为1-10μg/IP反应
摇床孵育2h。
4.吸取20μl的ChIP 级的含琼脂糖Protein A/G均一悬液（涡旋混匀）加到每个置于摇晃平台上的IP反应管中，4°孵育1h. 孵育后，除去下面底塞，将柱子放置于2ml的收集管中。3000g 离心30s，弃去废液。
5.塞入柱子底塞，加入0.5ml 的IP wash buffer 1 ,置于摇晃平板上，盖上盖子4°孵育5min。 除去底塞，将柱子置于新的收集管中；3000g离心30s。
6.重复步骤5两次，用IP Wash Buffer 2
7.重复步骤5一次，用IP wash buffer 3
8.除去残留的wash buffer 将柱子置于收集管中，3000g离心1min。
D．65℃解交联蛋白质和DNA复合物
1.重新塞底塞，加入150μl的1X IP Elution buffer 到洗涤后的柱中，盖上盖子，恒温孵育器65°孵育30min （摇晃）。如果没有恒温摇床，则可置于65°加热板40min。每隔10min 重悬。
2.在洗脱过程中，准备含6μl 5M Nacl
和2μl 20mg/ml Proteinase K /IP 反应的 1.5ml的离心管。
3.溶解10% total input sample 样 加入150μl IP Elution buffer 、6μl 5M Nacl 和2μl 20mg/ml proteinase K ，置于室温
4.步骤1中65°温育，从加热块中移除柱子，打开盖子和底塞，将柱子置于1.5ml 含Nacl 和蛋白酶K的预收集管，盖上盖子，6000g离心1min
5.弃去柱子，盖上1.5ml 离心管，漩涡所有的IP和
total-input
样本置于65°加热块中1.5h。
E．消化蛋白，纯化富集的DNA
1.每个IP
和total input sample，加750μl的DNA binding buffer；
2.吸取500μl/样本
到DNA Clean-Up 柱子上置于2ml 收集管中，10000g离心1min,弃去滤液；
3.吸取残留的sample 到同样的DNA clean-up 柱子，10000g离心1min，弃去滤液；
4.将上述柱子置于收集管中，加入750μl的DNA Column Wash buffer。10000g离心1min弃滤液；
5.将柱子置于空的收集管中，10000g离心2min；
6.将柱子置于新的1.5ml离心管中，吸取50μl的DNA Column Elution1. Solution 直接加入到柱子中央；
7.10000g离心1min，弃柱子，得到的溶液为纯化的DNA，可进行实时荧光定量PCR检测
ChIP实验常见问题
1：非特异性抗体对照背景高
可能原因：
（1）非特异性结合
Protein A
或G beads
（2）ChIP
缓冲液污染了
（3）有些Protein A or G beads
产生高背景
解决办法：
（1）将标本和beads混合孵育1hr后去除，然后再加入抗体进行反应（包括预纯化标本步骤）
（2）重新配制新的缓冲液
（3）有些Protein A/G beads
产生高背景.尽量使用在非特异性对照中背景很低的Protein A/G beads
2：背景高、电泳结果难以分辨大小
可能原因：DNA片段太大
解决办法：对不同类型的细胞，DNA
片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于1.5 kbp.
如果使用酶消化染色质的话，应该可以看到单个核小体的存在
(175 bp)
3：信号弱
可能原因及解决办法：
（1）染色质的片段太小了。
染色质超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP，酶切反应足够来片段化染色质了。
（2）如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久。
用甲醛交联10-15分钟然后用PBS洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛.过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合。
（3）染色质用量不足。推荐每次实验染色质的用量是25
μg
（4）免疫沉淀用抗体量不足。推荐使用3-5
μg抗体进行初次实验，如果没有信号则可以增加到10μg的用量。
（5）特异性的抗体结合被清除了。洗液中的NaCl
浓度不能高于500 mM
，因为这个浓度过强，有可能会消除特异性的抗体结合。
（6）细胞没有被完全裂解。推荐使用RIPA buffer裂解细胞（参考X-ChIP方法）。
（7）目标区域没有抗体被富集。
抗体结合表位不存在感兴趣的DNA区域。使用阳性对照抗体，以保证整个操作过程的正确性，如H3K4me3/H3K9me3抗体对应active/inactive promoters。
（8）不适合使用N-ChIP方法。当待测蛋白和DNA的结合比较弱或者离DNA比较远时，最好使用X-ChIP。因为交联可以避免在操作过程中蛋白质从DNA上脱落下来。而Histones通常具有很强的DNA亲和力，因此分析时常用N-ChIP。
（9）所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法。
在交联过程中，可能抗体的结合表位被封闭了。推荐使用多克隆抗体，因为具有多个抗原结合表位从而增加了IP靶蛋白的成功率。
（10）使用了错误的抗体亲和beads。
Protein A和G结合不同的Ig.
选择使用能有效结合抗体的Protein beads。推荐使用protein A和G的葡聚糖混合物从而增加沉淀抗体的成功率。
4：PCR扩增出现问题
可能原因及解决方法
（1）所有标本包括模板对照
PCR结果信号均过高。real-time PCR溶液污染了，换用新鲜配制的新溶液重新进行PCR。
（2）标本PCR结果阴性。使用
standard/input DNA确认引物是否正确。
